REQUISITOS
Para el practico No 9 del laboratorio cada estudiante deberá de estar con su atuendo para el laboratorio: pijama azul, barbijo, alcohol al 70%, bolsa de plástico, un retazo de tela que no deje pelusas, para limpiar el material, marcador permanente de vidrio, cinta masking de 1,5 cm de ancho.
El aislamiento del material genético es muchas veces el punto de partida para diversos experimentos posteriores en la investigación de enfermedades genéticas, o microorganismos, virus que causan dichos trastornos de salud, por lo tanto, es el paso más crucial en cualquier técnica de biología molecular o biotecnología recombinante.
La extracción del DNA y RNA sigue protocolos con reactivos estandarizados, muchos de los cuales están disponibles en kits comerciales de calidad CONTRALADA, la extracción exitosa de ácidos nucleico de alta calidad de las muestras requiere una interrupción suficiente de los tejidos y las estructuras celulares, la desnaturalización de los complejos de nucleoproteínas, la inactivación de las nucleasas y la purificación de ácidos nucleicos, estos pasos se pueden modificar en función del ácidos nucleico de interés y la fuente de la muestra a ser analizada.
La extracción orgánica es un método que implica el uso de disolventes orgánicos como el cloroformo, fenol con tris fosfato o una mezcla de fenol y cloroformo para desnaturalizar y precipitar las proteínas de la solución de ácidos nucleicos, para eliminar el RNA se utiliza enzimas que degradan este material genético la enzima ARNasa, el DNA obtenido se precipita con etanol absoluto a temperaturas de 0ºC.
La extracción automatizada es un método que utiliza kits comerciales, estos están constituidos por polímeros utilizados en la cromatografía por afinidad, o la utilización de perlas magnética, membranas de silice para aislar el DNA de los linfocitos. Los eventos de estos kits, suelen incluir la lisis celular, inactivación de las nucleasas, unión del DNA a la superficie magnética o la membrana, lavado y elución; estos métodos son rápidos y eficientes reduce el riesgo de contaminación con aerosoles, contaminación cruzada.
Extracción del ADN plasmídico de E. coli
El ADN plasmídico es un tipo de ADN extracromosómico que se encuentra en algunas bacterias, como E. coli. Los plásmidos son moléculas de ADN circulares y pequeñas que pueden replicarse independientemente del cromosoma bacteriano.
La extracción del ADN plasmídico de E. coli es un procedimiento fundamental en biología molecular y biotecnología. El método más común para la extracción de ADN plasmídico es la lisis alcalina. Este método se basa en la diferencia de tamaño y estructura entre el ADN plasmídico y el ADN cromosómico de la bacteria.
Pasos generales para la extracción de ADN plasmídico mediante lisis alcalina:
- Cultivo bacteriano: Se cultivan las bacterias E. coli que contienen el plásmido de interés en un medio de cultivo adecuado.
- Lisis celular: Se lisan las células bacterianas para liberar el contenido celular, incluyendo el ADN plasmídico y el ADN cromosómico.
- Neutralización: Se neutraliza la solución para precipitar el ADN cromosómico y las proteínas celulares, dejando el ADN plasmídico en solución.
- Purificación: Se purifica el ADN plasmídico mediante técnicas como la cromatografía de columna o la precipitación con alcohol.
Aplicaciones en biotecnología
El ADN plasmídico tiene numerosas aplicaciones en biotecnología, entre las que se incluyen:
- Clonación de genes: Los plásmidos se utilizan como vectores para introducir genes de interés en bacterias u otros organismos.
- Expresión de proteínas: Los plásmidos se utilizan para expresar proteínas recombinantes en bacterias u otros organismos.
- Terapia génica: Los plásmidos se utilizan para introducir genes terapéuticos en células humanas.
- Diagnóstico molecular: Los plásmidos se utilizan para detectar la presencia de genes específicos en muestras biológicas.
