REQUISITOS
Para el practico No 2 del laboratorio cada estudiante deberá de estar con su atuendo para el laboratorio: pijama azul, barbijo, alcohol al 70%, bolsa de plástico, un retazo de tela que no deje pelusas, para limpiar el material, marcador permanente de vidrio, cinta masking de 1,5 cm de ancho,
La cuantificación de ácidos nucleicos, que abarca el ADN de doble cadena (dsDNA), el ADN de una sola cadena (ssDNA) y la cuantificación de ARN, es un proceso básico en las aplicaciones de biotecnología, que requieren el conocimiento de la concentración de la muestra antes de los experimentos posteriores. Ambos tipos de ácido nucleico generalmente se cuantifican utilizando una de dos tecnologías ópticas: espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis) o mediciones de fluorescencia.
La cuantificación precisa de las concentraciones de ácido nucleico es fundamental para las aplicaciones posteriores, como la secuenciación de última generación, la transfección, la PCR y la clonación. Dichas aplicaciones requieren con frecuencia un rango objetivo de concentración y pureza de ácido nucleico para un rendimiento óptimo y una determinación imprecisa de las concentraciones puede causar una mayor variabilidad o el fracaso del ensayo.
FLUOROMETRIA
La técnica fluorométrica para la cuantificación del ADN se basa en el uso de colorantes fluorescentes que se unen específicamente al ADN de doble cadena (dsDNA). Estos colorantes emiten una señal fluorescente cuando se iluminan con una longitud de onda determinada. La intensidad de la señal es proporcional a la concentración de dsDNA en la muestra. Estos instrumentos detectan la señal y la comparan con reactivos de calibración para determinar la cantidad del DNA .
El análisis fluorométrico proporciona una sensibilidad alrededor de 1000 veces mayor que los métodos basados en la absorbancia. También es una característica de los ensayos de fluorescencia que son altamente específicos para el analito de interés en comparación con los de absorbancia.
La cuantificación de ADN, ARN o proteína a través de métodos fluorométricos requiere la unión de fluoróforos específicos del analito a la muestra de interés. El complejo muestra/fluoróforo se ilumina con una longitud de onda de excitación específica de una fuente de luz. El fluoróforo emite luz en un espectro característico y la cantidad de luz emitida es proporcional a la cantidad de analito en la muestra. La luz se captura y registra como unidades fluorescentes relativas (RFU). La concentración de muestras desconocidas se puede entender a través de la correlación con una curva estándar de muestras de concentración conocida.
Los colorantes fluorescente que se usan para la cuantificación del DNA son Hoechst 33258, SYBER Green, estos colorantes tienen diferentes rangos de detección y afinidad por DNA es importante elegir el colorante adecuado según el tipo y la calidad de la muestra.
Los cuantificadores de fluorescencia pueden cuantifica DNA entre 0,5 pg/uL y 4000 ng/uL