REQUISITOS
Para el laboratorio cada estudiante deberá de estar con su atuendo para el laboratorio: pijama azul, barbijo, alcohol al 70%,
Las enzimas de restricción son herramientas esenciales en biología molecular, utilizadas para el corte específico de secuencias de ADN en posiciones definidas. Su descubrimiento ha revolucionado el campo de la genética, facilitando técnicas como la clonación, la ingeniería genética y la edición del genoma.
1. Fundamento de las Enzimas de Restricción
Las enzimas de restricción, también llamadas endonucleasas de restricción, son proteínas que reconocen secuencias específicas de ADN y las cortan en sitios precisos. Estas enzimas se encuentran de forma natural en bacterias, donde actúan como un mecanismo de defensa contra el ADN de virus invasores (bacteriófagos).
Tipos de Enzimas de Restricción
Las enzimas de restricción se clasifican en tres grupos principales:
- Tipo I: Cortan lejos de su sitio de reconocimiento y requieren ATP.
- Tipo II: Cortan dentro o cerca de la secuencia específica. Son las más utilizadas en biología molecular.
- Tipo III: Requieren ATP y cortan a cierta distancia del sitio de reconocimiento.
Patrones de Corte
Las enzimas de restricción pueden generar diferentes tipos de extremos tras el corte del ADN:
- Extremos romos: No dejan bases sobresalientes. Ejemplo: SmaI
- Extremos cohesivos o pegajosos: Dejan bases sobresalientes, facilitando la unión con fragmentos complementarios. Ejemplo: EcoRI
2. Técnicas de Laboratorio con Enzimas de Restricción
a) Digestión del ADN con Enzimas de Restricción
- Se incuba el ADN con una enzima de restricción específica en un buffer óptimo de reacción.
- Se deja actuar a una temperatura determinada (generalmente 37°C).
- Se detiene la reacción mediante inactivación térmica o adición de EDTA.
- Se analiza el fragmento digerido mediante electroforesis en gel de agarosa.
b) Mapeo de Restricción
- Se usan diferentes enzimas de restricción para obtener un “mapa” de los sitios de corte en una molécula de ADN.
- Útil en la verificación de construcciones plasmídicas y análisis genético comparativo.
c) Clonación de ADN
- Se corta el ADN de interés con una enzima de restricción.
- Se corta un vector (plásmido) con la misma enzima.
- Se unen los fragmentos con ligasa.
- Se transforma en células competentes para su expresión o replicación.
d) Diagnóstico Molecular
- Se aplican enzimas de restricción para detectar mutaciones en genes específicos, como en la RFLP (Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción).
3. Aplicaciones de las Enzimas de Restricción
a) Ingeniería Genética y Clonación Molecular
- Permiten insertar genes en plásmidos para la producción de proteínas recombinantes.
b) Diagnóstico de Enfermedades Genéticas
- Técnicas como RFLP permiten detectar mutaciones asociadas a enfermedades hereditarias.
c) Secuenciación y Análisis de ADN
- Se emplean en la preparación de muestras para secuenciación de próxima generación (NGS).
d) Estudios Evolutivos y Filogenéticos
- Permiten analizar diferencias genéticas entre especies mediante la comparación de patrones de corte.
