REQUISITOS
Para el practico No 9 del laboratorio cada estudiante deberá de estar con su atuendo para el laboratorio: pijama azul, barbijo, alcohol al 70%, bolsa de plástico, un retazo de tela que no deje pelusas, para limpiar el material, marcador permanente de vidrio, cinta masking de 1,5 cm de ancho.
La medición fiable de la concentración de ADN es importante para muchas aplicaciones en biología molecular. La espectrofotometría y la fluorometria, se usan comúnmente para medir la concentración de ADN genómico y plásmido. La espectrofotometría se puede usar para medir cantidades de microgramos de muestras de ADN puro (es decir, ADN que no está contaminado por proteínas, fenol, agarosa o ARN).
La concentración de ADN puede determinarse midiendo la absorbancia a 260 nm (A260) en un espectrofotómetro utilizando una cubeta de cuarzo. Para una mayor precisión, las lecturas deben estar entre 0.1 y 1.0. Una absorbancia de 1 unidad a 260 nm corresponde a 50 μg de ADN genómico por ml (A260 =1 para 50 μg/ml; basado en una longitud de trayectoria estándar de 1 cm. Esta relación es válida solo para mediciones realizadas a pH neutro, por lo tanto, las muestras deben diluirse en un tampón bajo en sal con pH neutro (por ejemplo, Tris· Cl, pH 7,0). Un ejemplo del cálculo involucrado en la cuantificación de ácidos nucleicos cuando se utiliza un espectrofotómetro (ver Medición espectrofotométrica de la concentración de ADN). Cuando se trabaja con pequeñas cantidades de ADN, como productos de PCR purificados o fragmentos de ADN extraídos de geles de agarosa, la cuantificación a través del análisis de gel de agarosa puede ser más efectiva.
Técnicas de cuantificación del ADN
La cuantificación del ADN es un paso esencial en muchas técnicas de biología molecular y biotecnología. Permite determinar la cantidad de ADN presente en una muestra, lo cual es fundamental para asegurar la precisión y confiabilidad de los resultados.
Fundamentos
Las técnicas de cuantificación del ADN se basan en propiedades físicas o químicas del ADN que son proporcionales a su concentración. Estas propiedades pueden ser la absorción de luz ultravioleta, la fluorescencia o la unión a colorantes específicos.
Conceptos clave
- Absorbancia: Medida de la cantidad de luz que absorbe una sustancia a una longitud de onda específica. El ADN absorbe luz ultravioleta a 260 nm.
- Fluorescencia: Emisión de luz por una sustancia después de absorber luz de una longitud de onda diferente. Se utilizan fluoróforos que se unen al ADN y emiten fluorescencia al ser excitados.
- Curva de calibración: Gráfica que relaciona la señal (absorbancia o fluorescencia) con la concentración de ADN de muestras de concentración conocida. Se utiliza para determinar la concentración de muestras desconocidas.
Técnicas de cuantificación
Existen diversas técnicas para cuantificar el ADN, cada una con sus ventajas y desventajas. Algunas de las más comunes son:
- Espectrofotometría UV: Mide la absorbancia del ADN a 260 nm. Es un método sencillo y rápido, pero puede ser menos preciso si hay contaminantes que también absorben a esa longitud de onda.
- Fluorometría: Utiliza fluoróforos que se unen al ADN y emiten fluorescencia al ser excitados. Es un método más sensible y específico que la espectrofotometría UV.
- Electroforesis en gel: Separa el ADN en función de su tamaño y carga. Se puede estimar la cantidad de ADN comparando la intensidad de las bandas con las de un estándar de concentración conocida.
Aplicaciones
La cuantificación del ADN es fundamental en diversas aplicaciones, como:
- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Se necesita conocer la concentración de ADN para calcular la cantidad de ADN molde y de cebadores.
- Secuenciación de ADN: Se requiere una cantidad precisa de ADN para obtener resultados de secuenciación confiables.
- Clonación: Se necesita conocer la concentración de ADN para calcular la cantidad de ADN a insertar en un vector.
- Diagnóstico molecular: Se utiliza para determinar la cantidad de ADN de un organismo o de un gen específico.
